Meloidogyne hapla

Meloidogyne hapla

Meloidogyne hapla, le nématode cécidogène du Nord, est une espèce de vers ronds de la famille des Heteroderidae. C'est un important parasite des plantes classé en parasitologie dans le genre Meloidogyne (nématodes à galles ou nématodes des nodosités des racines). En anglais, il se nomme root-knot nématode.

C'est l'une des quatre principales espèces de nématodes répandues dans le monde. Elle attaque de nombreuses espèces de plantes dicotylédones sauvages et cultivées, parmi lesquelles figure notamment la pomme de terre, la carotte, la laitue et la tomate.

Meloidogyne hapla

Nom binominal

Meloidogyne hapla
Chitwood, 1949

Nous avons établi Meloidogyne hapla en tant que nématode parasite de plante modèle traitable se prêtant à la génétique directe et inversée, et nous présentons une séquence complète du génome. À 54 Mbp, M. hapla représente non seulement le plus petit génome de nématode jamais achevé, mais aussi le plus petit métazoaire, et définit une plate-forme pour élucider les mécanismes du parasitisme par le plus grand groupe non contrôlé de phytopathogènes au monde. Le génome de M. hapla code nettement moins de gènes que le nématode autonome Caenorhabditis elegans (notamment par la réduction des récepteurs odorants et d’autres familles de gènes), mais il a acquis horizontalement de nombreux gènes soupçonnés d’être impliqués dans les adaptations à parasitisme. Dans certains cas, une duplication en tandem et une amplification ont eu lieu avec des gènes suspectés d'être acquis horizontalement et impliqués dans le parasitisme des plantes. Bien que M. hapla et C. elegans aient divergé il y a plus de 500 millions d'années, de nombreuses voies de développement et biochimiques, y compris celles de la formation de dauer et d'ARNi, sont conservées. Bien que l'organisation globale du génome ne soit pas conservée, il existe des zones de microsynthèse qui peuvent suggérer une fonction biologique primaire des nématodes pour ces gènes dans ces zones. Cette séquence et cette carte représentent une mine d’informations biologiques sur la nature du parasitisme des nématodes des plantes et sur son évolution.

Les nématodes sont un phylum animal abondant et riche en espèces. Ils partagent un plan corporel commun sur lequel diverses adaptations ont évolué, ce qui permet aux nématodes d'occuper essentiellement toutes les niches écologiques, y compris en tant que parasites de nombreux autres organismes ( 1 ). Le parasitisme des plantes semble s'être développé indépendamment dans trois des 12 principaux clades de nématodes ( 2 ) et entraîne des pertes annuelles pour l'agriculture mondiale estimées à plus de 100 milliards de dollars américains ( 3 , 4 ). La majorité des dommages sont causés par des formes endoparasitaires sédentaires dans l'ordre Tylenchida, qui comprend les nématodes cécidogènes (Meloidogyne spp. RKN). RKN a une distribution cosmopolite et une gamme d'hôtes qui couvre la plupart des cultures, bien que les espèces individuelles de RKN présentent une gamme d'hôtes plus restreinte. Les RKN femelles matures libèrent des centaines d'œufs à la surface de la racine qui éclosent dans le sol en tant que larves du deuxième stade (L2) et réinfectent généralement la même plante. Les RKN L2 ont des fonctions similaires à celles des larves dauer ( 5 ), décrites pour la première fois comme une adaptation au parasitisme pour surmonter les conditions environnementales défavorables et faciliter la dispersion ( 6 ), mais ont été étudiées au mieux chez le nématode vivant libre Caenorhabditis elegans ( 7 ) . Ces larves sont arrêtées pour le développement, mobiles, sans alimentation, sans âge et ont une longue durée de vie. À l'instar de C. elegans dauers, les RKN L2 résistent au détergent ( 5 ), utilisent la voie du glyoxylate ( 8 ) et présentent une morphologie intestinale avec des microvillosités luminales clairsemées et de nombreuses vésicules de stockage des lipides permettant la survie à long terme dans le sol. Les RKN L2 pénètrent dans la racine et migrent de manière intercellulaire dans le cylindre vasculaire. La migration s'accompagne d'une sécrétion importante de protéines via le stylet et, étant donné que les changements de morphologie des glandes pharyngiennes sont corrélés à l'établissement de l'interaction parasitaire, les sécrétions de ces glandes joueraient un rôle central dans les interactions hôte-parasite ( 9 ). Diverses fonctions enzymatiques pour les sécrétions ont été proposées, et le clonage et le séquençage de gènes individuels codant pour des protéines glandes ont permis de discerner avec certitude leur nature.

Séquençage du génome de nématodes libres C. elegans ( 10 ), C. briggsae ( 11 ) et Pristionchus pacificus ( 12 ) ont fourni des génomes de référence à comparer avec les nématodes parasites, et récemment un projet de séquence du génome du parasite humain a été publié Brugia malayi ( 13 ). Nous présentons ici le génome de l’espèce RKN, Meloidogyne hapla. Bien que de nombreuses espèces de RKN se reproduisent par parthénogenèse mitotique ( 1 ), de nombreux isolats de M. hapla se reproduisent par parthénogenèse méiotique facultative où se produisent des croisements sexuels, mais, en l'absence de mâles, l'état diploïde est restauré en réunissant les chromosomes sœurs d'une même méiose ( 14 ). Nous avons exploité ce système génétique unique pour la construction d'une carte de liaison que nous avons ancrée dans la séquence et en tant que moyen de supprimer l'hétérogénéité des séquences d'ADN afin de faciliter l'assemblage du génome à partir d'une approche par fusil de chasse à génome entier (WGS). En effet, la capacité de produire des lignes hautement hybrides a considérablement amélioré la fidélité de notre assemblage.

Une découverte frappante de ce projet est que M. hapla code pour environ 5 500 gènes de codage de protéines de moins que C. elegans. Nous avons noté plusieurs familles de gènes dont le nombre est significativement inférieur à celui observé chez C. elegans, et nous avons également confirmé l'hypothèse selon laquelle le transfert horizontal de gènes a joué un rôle dans l'évolution du parasitisme. Collectivement, l’acquisition de la séquence de M. hapla représente une étape majeure dans la compréhension de l’évolution des niches de nématodes. Un projet de séquence de génome a récemment été acquis pour Meloidogyne incognita ( 15 ), une espèce aneuploïde mitotiquement parthénogénétique, et la finition simultanée de ces génomes permettra de futures approches génomiques comparatives pour étudier le parasitisme et l'évolution des nématodes. Les nématodes phytoparasites comptent parmi les organismes nuisibles les plus dommageables et les plus difficiles à contrôler de l'agriculture mondiale. Pour répondre aux demandes mondiales actuelles et futures en matière d'alimentation, de fibres et de bioénergie, il sera nécessaire de minimiser ces pertes et de développer de nouveaux paradigmes de contrôle. Ces séquences génomiques constituent un nouveau premier pas vers cet objectif.

Résultats et discussion

Carte de couplage génétique de M. hapla.

L'analyse de 293 marqueurs ADN AFLP présentant un polymorphisme entre les parents VW8 et VW9 a permis d'assembler une carte génétique de M. hapla avec 15 groupes de liaison ( Fig. 1 ). Sur la base de l'examen cytologique, les souches parentales ont un complément de 16 chromosomes ( 16 ) et ainsi, la plupart des chromosomes peuvent être représentés sur cette carte. La somme des distances génétiques des marqueurs dans les groupes de couplage actuels est de 771 cM, ce qui nous permet d'estimer une distance génétique totale d'environ 1 000 cM et une distance physique à génétique moyenne de 50 kb / cM. Cette carte de liaison est la carte la plus dense pour tous les nématodes parasites des plantes. Comme indiqué précédemment ( 14 ), la ségrégation est de 1: 1 pour la plupart des marqueurs, ce qui reflète le nouveau mécanisme parthénogénétique, bien que nous ayons trouvé plusieurs zones où la ségrégation s'écartait considérablement d'un ratio de 1: 1, ce qui pourrait indiquer que les traits affectant la survie ou le parasitisme correspondent à ces régions. . Nous avons fusionné cette itération de la carte avec la séquence du génome en utilisant des marqueurs codominants issus du croisement VW9 × VW8 ( Fig. 1 ).

Fig. 1.

Carte de liaison génétique de M. hapla. Les groupes de liaison (LG) avec trois marqueurs ou plus à la LOD8 sont affichés. À cette LOD, 17 des 293 marqueurs n’ont pas pu être affectés à des groupes de liaison (boîte jaune). H1 et H2 sont des marqueurs PCR utilisés pour surveiller les croisements. Les marqueurs avec le même nom et le suffixe a ou b se séparent en tant que marqueurs codominants. Les étoiles indiquent les marqueurs qui s'écartent de la séparation 1: 1 à P > 0,01. Les nombres à gauche des groupes de liaison indiquent les distances génétiques en cM. Les marqueurs surlignés en rose sont codominants et ont été fusionnés avec la séquence génomique de VW9. Les chiffres en bleu indiquent le numéro de contig provenant de l'ensemble.

Séquence génomique provisoire et découverte du gène M. hapla .

Des banques d’insert de tailles multiples ont été construites à partir d’ADN de la lignée hybride VW9, et les réactions de séquençage par injection totale du génome ont été analysées par 1,04 million de lectures générant une séquence de 587 millions de paires de bases ( information complémentaire (SI), Tableau S1 ). En utilisant Arachne ( 17 ), ceux-ci ont été assemblés dans 1 523 échafaudages, ce qui a permis de couvrir 10,4 × du génome de -54 Mb ( 18 ) et de couvrir 99% du génome de VW9 ( tableau 1 ).

Tableau 1.

Comparaison des statistiques du génome de M. hapla avec C. elegans et B. malayi (26 )

Malgré une teneur inhabituellement basse en G + C ( Tableau 1 ), 83% du génome de VW9 représentent une séquence unique, contribuant probablement à l'assemblage robuste du génome. Nous avons examiné la séquence répétitive et trouvé principalement des répétitions simples. Environ 1% de la séquence répétitive code pour des répétitions caractérisées, y compris des transposons d'ADN ( Fig. S1 , tableau S2 ). Nous avons trouvé 323 exemplaires de l'équivalent M. hapla du transposon Tc1 ( 19 ), nombre presque identique à celui trouvé chez C. elegans . De manière similaire, à la fois en nombre de gènes et en structure prédite, le leader du transsplis de SL-1 ( 20 ) chez M. hapla est équivalent à C. elegans , mais les loci de SL-1 semblent dispersés dans le génome de M. hapla . De plus, de petits groupes de satellites ont été trouvés, ainsi que des grappes de séquences d'ARNr (5S, 16S-5.8S-28S).

Nous avons utilisé Glimmer et FgenesH (tous deux formés de manière indépendante sur environ 3 000 modèles de gènes de M. hapla sélectionnés manuellement) pour la prédiction de gènes ab initio à partir d'une séquence génomique et avons identifié 14 420 gènes codant des protéines dans M. hapla . L'alignement de 6 711 M. hapla EST Unigenes dérivés de 26 707 EST a montré un alignement correct dans l'orientation et l'ordre, ce qui suggère que l'assemblage de la séquence est robuste et que le mauvais assemblage des régions codant pour les gènes est limité au maximum. La densité de gènes est la plus élevée jamais enregistrée pour un nématode, bien que la longueur moyenne des gènes semble très similaire à celle d’autres génomes de grande taille complètement séquencés ( tableau 1 ). Les tailles moyennes des introns et des exons (respectivement 55 et 145 pb) sont très similaires à celles de C. elegans ( tableau 1 ). L'ensemble de données sur les protéines (HapPep3) déduit des 14 420 gènes prédits de M. hapla a été utilisé comme interrogation dans une recherche HMM dans la base de données Pfam22 et les 10 correspondances les plus importantes avec une valeur E inférieure à E-05 ont été récupérées. Une analyse similaire a été réalisée en utilisant la version de wormpep185 ( www.wormbase.org ) pour la comparaison entre M. hapla et C. elegans . Il y a eu 4 943 allumettes à M. hapla et 13 207 allumettes à C. elegans. Huit des 20 principaux domaines pfam de M. hapla font également partie des 20 premiers pour C. elegans ( Fig. 2 A ).

Fig. 2

Analyse des protéines pour le génome de M. hapl. (A  Les 20 domaines protéiques les plus communs trouvés chez M. hapla, basés sur une recherche HMM de Pfam22, comparés au nombre d'occurrences de chaque domaine trouvé chez C. elegans. Les domaines situés dans les 20 domaines les plus courants pour C. elegans sont indiqués par un *. Le nombre de domaines détectés est indiqué. (B) Pourcentage de similarité de la séquence génomique avec les protéines connues catégorisées sur la base de la meilleure correspondance BlastX avec la base de données sur les protéines non redondantes du NCBI. (C) Résumé des trois principales catégories d’OA basées sur une comparaison des séquences protéiques avec la base de données Uniprot swissprot + trembl.

Familles de gènes chez M. hapla .

L'examen du répertoire des gènes de M. hapla révèle que la plus grande famille de gènes de C. elegans , la famille de récepteurs couplés à la protéine G (RCPG: 1 011 gènes) ( 21 , 22 ), est considérablement réduite chez M. hapla (147 gènes). ( Fig. S2 ). Peut-être cette réduction du nombre de gènes représente-t-elle la perte de gènes observée au cours de la spécialisation de niche pour devenir un parasite interne des plantes (un environnement homéostatique par rapport au sol), les phases de la vie en dehors de la plante étant limitées à l'œuf et à la L2 dauer (les deux avec un accès neuronal limité l'environnement). Alternativement, cette disparité peut refléter l’expansion du gène chez C. elegans pour son créneau unique. Un schéma similaire existe pour d'autres familles de gènes chez M. hapla par rapport à C. elegans. Par exemple, le nombre de gènes de la famille des récepteurs nucléaires des hormones stéroïdiennes (284 gènes, C. elegans) est d'environ 25% chez M. hapla (76 gènes), et M. hapla code pour 81 gènes du collagène, contre 165 en C. elegans. Puisque nous supposons que les récepteurs et les collagènes des hormones stéroïdiennes jouent probablement un rôle clé dans la biologie fondamentale des nématodes, ces réductions sont surprenantes et reflètent soit le résultat de fortes pressions réduisant le génome de M. hapla , soit le développement de C. elegans . Sans surprise, près de la moitié des gènes auxquels nous pouvons attribuer une fonction chez M. hapla (sur la base de la similarité de base de données) présentent les similitudes les plus élevées avec les gènes de C. elegans ( Fig. 2 B ), le deuxième groupe le plus important présentant une similitude avec nématodes parasites. Les autres catégories sont les gènes de M. hapla avec des correspondances significatives (et uniques) avec d'autres gènes d'animaux et de plantes. Dans la mesure du possible, les gènes ont été adaptés à la hiérarchie GO (Fig. 2 C ).

M. hapla possède des suites de gènes acquis à partir de bactéries via un transfert de gène horizontal (HGT).

Étant donné que la littérature contient des arguments convaincants à l’appui de l’hypothèse selon laquelle RKN a acquis des gènes via HGT au cours de son évolution ( 23 , 24 ), nous avons recherché des gènes de M. hapla codant pour des protéines avec des correspondances significatives uniquement avec des protéines bactériennes mais pas avec d’autres protéines animales. Depuis leur première découverte chez les nématodes phytopharmaceutiques ( 25 , 26 ), beaucoup de ces gènes ont été soumis à un examen minutieux individuel. Il n’est donc pas surprenant que nous ayons trouvé de nombreux candidats HGT identifiés chez les tylenchides, notamment l’hydroxymuconique, l’endolucanase, les endoglucanases, la chorismate mutase, l’exo-polygalacturonase, la glutamine synthétase, l’ isochorismatase, la l- thréonine et la n-lodre, et autres pectinases ( 9 ). Nous avons également découvert des candidats qui semblent être présents dans les bactéries et les plantes, mais pas chez les animaux ou d'autres eucaryotes, notamment un cyanate lyase et une fructofuranosidase.

En plus d’identifier tous les candidats HGT connus précédemment attribués à RKN, nous avons examiné leur distribution à l’échelle du génome, révélant, par exemple, que M. hapla code des cellulases au niveau de six loci ( Fig. S3 ), mais que quatre seulement Prise en charge des EST, suggérant que deux des copies sont des pseudogènes ou qu’elles sont exprimées d’une manière qui n’est pas échantillonnée par les EST. L’exemple le plus fascinant d’un gène RKN apparemment acquis par HGT est celui de la pectate lyase. Découvert à l'origine sous forme de protéines sécrétées ( 9 , 27 ), notre séquence a révélé que M. hapla code pour une famille de 22 pectate lyases. Commun dans les champignons phytopathogènes, cet enzyme est responsable de la dépolymérisation de la pectine, principalement dans la lamelle moyenne de la paroi cellulaire de la plante, et joue probablement un rôle dans la migration des nématodes et éventuellement dans la régulation de la formation et de la maintenance des sites d'alimentation. L'analyse de la distance protéique et de la jonction entre voisins d'un alignement à séquences multiples de ces protéines déduites suggère deux clades principaux ( Fig. 3 A ), reflétant éventuellement deux événements HGT discrets. Les deux clades ont ensuite connu une expansion, reflétant probablement une diversification de la fonction des gènes au cours de l'évolution du RKN. Dans trois cas, les gènes codant pour les pectate lyases les plus similaires les uns aux autres sont adjacents dans le génome ( figure 3 ), ce qui est cohérent avec la duplication récente en tandem. Ainsi, malgré la compaction apparente du génome de M. hapla comparée à celle de C. elegans, les gènes essentiels à l’interaction parasitaire se sont développés.

Fig. 3

La famille du gène pectate lysae chez M. hapla . (A) Analyse de jonction entre voisins de pectate lysases codées par 22 gènes dans le génome de M. hapla ; ces enzymes ne se trouvent pas chez C. elegans . La pectate lysase sécrétée de Streptomyces coelicolor a été utilisée en tant que groupe externe. Les couleurs correspondent aux emplacements génomiques indiqués en B.

Catalogage du secretome M. hapl .

Il est largement admis que les sécrétions produites par les nématodes parasites des plantes jouent un rôle dans la pathogenèse des plantes ( 27 ). Notre examen initial des gènes de sécrétion connus dans les bases de données publiques a révélé un total de 70 orthologues présumés de protéines sécrétées par le nématode parasitaire d'origine végétale ( Tableau S3 ). Pour identifier de nouvelles protéines putatives sécrétées par M. hapla , nous avons recherché les séquences signal de toutes les 14 420 protéines prédites de HapPep3 à l'aide de SignalP ( 28 , 29 ). Selon les deux algorithmes de recherche SignalP disponibles, un total de 1 534 protéines avait des séquences signal et une recherche de régions transmembranaires supposées en utilisant TM-HMM ( 30 ), qui a identifié un total de 832 protéines avec un signal de sécrétion, mais dépourvu de membrane. hélices spatiales. Ces protéines ont été comparées à l'ensemble total de protéines de C. elegans dans la version 185 de WormPep ( http://www.wormbase.org ), ce qui a révélé que 360 ​​correspond de manière significative à une protéine de C. elegans . Les 472 protéines restantes ont été comparées à la base de données non redondante de séquences peptidiques du Centre national d'information sur la biotechnologie (NCBI), révélant un total de 38 séquences avec des correspondances significatives. Nombre de ces associations correspondent aux protéines de nématode parasite des plantes suggérées pour jouer un rôle dans le parasitisme, ainsi qu'aux protéines de B. malayi ( 13 ). Les autres sont des candidats à des protéines susceptibles de jouer un rôle dans la définition de l'interface hôte-parasite; leur découverte aide à valider le pouvoir de l'analyse du génome entier. En accord avec leurs caractères, beaucoup de ces protéines sécrétées n'ont pas été capturées dans notre cartographie GO ( Fig. 2 C ).

Explorer les voies de développement chez M. hapla.

De nombreuses voies de développement importantes chez C. elegans sont partiellement conservées dans le génome de M. hapla. La détermination du sexe est clairement un événement de développement clé chez tous les nématodes, mais M. hapla ne contient qu'un nombre très limité d'orthologues reconnaissables des gènes de détermination du sexe de C. elegans, notamment tra-1 et tra-2, bien que plusieurs gènes de compensation de dosage soient également conservés. . Dans un cas, l'opéron C. elegans contenant le gène de compensation de dosage dpy-30 est également conservé dans M. hapla ( Fig. S4 ), ce qui suggère que, même si le mode de vie diffère entre ces nématodes, certains événements en aval peuvent être conservés. Les gènes en amont de la voie, tels que xol-1, sdc-1 , sdc-3 et her-1 , n'ont pas été détectés, ce qui suggère que les signaux qui déclenchent ces voies sont substantiellement divergés. En revanche, de nombreux gènes des autres voies de C. elegans ont des orthologues clairs chez M. hapla, y compris des gènes de mort cellulaire programmée, reflétant peut-être leurs rôles principaux dans la biologie du développement généralisée des nématodes par opposition à la réponse à l'environnement.

L'examen du génome de M. hapla indique une conservation substantielle de la voie de l'ARNi. Par exemple, les gènes impliqués dans la fonction de petits ARN, y compris drsh-1 , pash-1 , dcr-1 , drh-2 , drh-3 , agl-1 , agl-2 , rrf-3 , eri-1 et pir -1 peut être discerné sans équivoque chez M. hapla , à la seule exception de rde-4 , qui n'est pas bien conservé à travers les distances phylogénétiques. L'utilisation de l'ARNi pour examiner la fonction des gènes est devenue un outil de recherche important. Si elle est sélectionnée de manière appropriée, elle est persistante sur plusieurs générations de RKN (31). Le potentiel de délivrance de petites molécules d'ARN via des plantes transgéniques pour le contrôle des nématodes a également été récemment démontré ( 32 ), soulignant l'importance d'une meilleure compréhension de ce processus dans RKN.

Un événement biologique clé dans le cycle de vie du parasite est la formation du stade infectant, qui correspond généralement au stade larvaire chez les nématodes; la capacité de former des dauers est largement conservée à travers le nématode. Chez C. elegans , l'entrée et la sortie des dauers sont contrôlées par les signaux environnementaux du «signal alimentaire», de la température et de la densité de population de nématodes, mesurés à l'aide d'une phéromone sécrétée; la nature précise des signaux utilisés par M. hapla est inconnue, mais diffère vraisemblablement de celle de C. elegans . L'analyse génétique chez C. elegans a identifié 32 gènes comme étant dauer-affectant (daf ) ( 7 ). Fait intéressant, beaucoup de ces gènes sont également liés à la durée de vie; dans certains cas, des mutations dans les gènes daf entraînent une durée de vie exponentielle plus longue chez C. elegans . Plusieurs voies génétiques chez C. elegans contrôlent à la fois l'entrée et la sortie du stade dauer. Ces voies se combinent pour former un système conceptuellement analogue à la détection du quorum chez les bactéries et jouent probablement un rôle dans la détection de l'environnement en général. La nature moléculaire de 20 des 32 gènes daf génétiquement caractérisés a été discernée. Caenorhabditis briggsae code pour 19 de ces 20, mais il lui manque la molécule de bêta-insuline impliquée dans la transduction du signal codée par daf-28. M. hapla code pour les orthologues forts de 14 gènes de C. elegans daf et pour les orthologues faibles de trois autres ( Tableau S4 ). A l'instar de C. briggsae, M. hapla n'a pas d'orthologue de daf-28 . L'identité moléculaire de ces gènes non trouvés dans M. hapla est associée à des signaux de développement spécifiques liés au mode de vie, ce qui démontre que, bien que les aspects mécaniques de base du développement soient conservés, la réponse à l'environnement du nématode parasite par rapport au nématode vivant librement est considérablement divergente. .

Structure d'opération et conservation de la syntaxe entre M. hapla et C. elegans.

Une caractéristique intéressante du génome de C. elegans est que de nombreux gènes sont organisés en opérons ( 20 ). Nous avons demandé à HapPep3 des orthologues des 3 539 protéines de C. elegans codées par les gènes trouvés dans les opérons et avons identifié 2 536 allumettes dans l'assemblage de M. hapl . En examinant les positions des correspondances pour les membres individuels de chaque opéron, nous avons identifié 140 opérons de C. elegans conservés au moins partiellement dans M. hapla , ce que nous définissons comme ayant au moins deux gènes d'un opéron à proximité immédiate ( Fig. S4 , Tableaux S5 et S6 ). Le plus grand opéron entièrement conservé consiste en trois gènes, bien qu'une cassette plus grande de quatre gènes de l'opéron à cinq gènes CEOP3272 ait également été conservée. Cette analyse n’exclut pas la possibilité que d’autres gènes de M. hapla puissent être organisés en opérons, mais suggère que les gènes régulés en raison d’une telle organisation chez C. elegans ne sont pas régulés de cette manière dans M. hapla. En raison de la petite taille du génome, les régions intergéniques de M. hapla ont également tendance à être courtes, ce qui rend difficile la prédiction ab initio de l'organisation de l'opéron. Cependant, la comparaison des gènes dans les opérons a apporté un éclairage considérable sur la conservation de la microsynthèse entre M. hapla et C. elegans. Dans de nombreux cas, le manque de conservation de l'opéron chez C. elegans résulte simplement du fait que les gènes orthologues ne sont pas présents chez M. hapla ( Fig. S4 ). De manière significative, les gènes correspondants chez C. elegans n'ont généralement pas de phénotype ARNi ( www.wormbase.org ), ce qui suggère une fonction redondante ou inutile . Nous avons également observé que, bien que des zones de microsynthèse se rencontrent dans le génome de M. hapla, la synténie est généralement brisée ou inexistante. Pris collectivement, ces données peuvent indiquer que M. hapla possède un génome minimal et non étendu, probablement en raison de son mode de vie biotrophique obligatoire.

Conclusions

La séquence complète du génome de M. hapla a des conséquences immédiates et importantes pour la recherche sur les nématodes des plantes et pour des études de biologie plus vastes. La capacité à effectuer de la génomique comparative en utilisant C. elegans, C. briggsae , P. pacificus , B. malayi et M. incognita , ainsi que d’autres génomes de nématodes parasites de plantes et d’animaux permettra d’approfondir la compréhension de l’évolution des parasites la capacité et le développement comparatif des nématodes. Étant donné que les formes parasitaires présentent des aspects développementaux distincts des formes libres, ces études peuvent révéler des moments critiques dans le cycle de vie des parasites obligatoires, qui peuvent constituer des cibles uniques et spécifiques des thérapies anti-nématodes. En particulier, des événements tels que le développement arrêté et la réponse aux signaux de l'hôte et de l'environnement peuvent être examinés en détail auparavant, ce qui était impossible. Bien que la machinerie précise puisse différer, ces stades de développement représentent des points clés du cycle de vie du parasite, et nous nous attendons à ce que certains mécanismes soient conservés entre les espèces, tandis que d'autres peuvent être très différents. Au-delà de cela, une meilleure compréhension des transitions biologiques dans RKN, telle que la dégénérescence de la musculature somatique lors de la transition d'une dauer migratrice L2 aux stades d'alimentation sédentaire, et la réacquisition ultérieure de muscles fonctionnels chez les hommes adultes migrateurs, peuvent avoir des implications pour disciplines générales, y compris la santé humaine.

De nombreuses bactéries pathogènes sont en train de perdre des gènes par des voies pour lesquelles elles peuvent compter sur leur hôte et ont donc un génome plus petit que celui de leurs homologues libres. La taille plus petite du génome de M. hapla en soi par rapport aux formes vivant librement pourrait indiquer un phénomène évolutif similaire, et les preuves actuelles indiquent que M. hapla possède moins de gènes que ses homologues vivant librement. Comme le répertoire des gènes du parasite est réduit, ces voies perdues ou handicapées peuvent également fournir des indices sur l’interaction complexe entre l’hôte et le parasite. Des domaines tels que l'identification des îlots de pathogénicité, des opérons de virulence et des gènes transférés horizontalement peuvent également faire l'objet d'une étude détaillée. À plus grande échelle, le génome complet de M. hapla constitue une plate-forme pour des études exploitant le profilage du transcriptome du génome entier pour poser des questions de pathogénicité, d'évolution et de développement. Enfin, la séquence fournit un tremplin pour le séquençage d’enquêtes d’autres espèces et genres chez les Tylenchida et les Nematoda.

Matériaux et méthodes

Construire une carte de liaison génétique de M. hapla.

Nous avions précédemment établi un système génétique pour M. hapla en exploitant le mode de reproduction parthénogénétique méiotique facultatif ( 14 ) et avons décrit la génération de 183 lignées F2 à partir d'un croisement de deux lignées hautement hybrides, VW8 et VW9 ( 15 ). Les marqueurs AFLP polymorphes ont été identifiés comme décrit dans la réf. 14 et utilisé pour génotyper ces descendants F2. Les données ont été rassemblées dans une carte de liaison à l'aide de JoinMap 3.0 ( 32 ).

Acquisition et assemblage de séquences.

Six banques WGS ont été construites à partir d’ADN génomique isolé d’œufs de M. hapla VW9 et le séquençage de l’ADN a été effectué à l’Institut conjoint du génome du Département de l’énergie et au Centre de biologie du parasitisme nématode sur les séquenceurs ABI 3730 et MegaBase. Les séquences découpées ont été assemblées à l'aide du paquet Arachne (Broad Institute) version 2.0.1. Une description complète des bibliothèques et des méthodes de traitement des séquences est fournie dans les méthodes SI . Les améliorations apportées à ces assemblages seront publiées sur ce site dès qu'elles seront disponibles. Des contigs et des échafaudages seront disponibles pour le téléchargement, ainsi que des fichiers Lisez-moi répertoriant les mises à jour de l'assemblage.

Découverte de gènes.

Pour former des programmes de découverte de gènes, nous avons d’abord sélectionné manuellement 124 groupes d’EST pour définir sans équivoque les transcriptions complètes de M. hapla. Nous avons ensuite utilisé PASA (Programme pour l’assemblage des alignements en épissure), qui assemble des gènes complets en alignant les données d’EST avec la séquence génomique. Nous avons analysé les résultats PASA pour la structure des gènes, donnant ainsi 2 974 modèles de gènes utilisés pour former indépendamment Glimmer et FgenesH pour la découverte de gènes ab initio. Avec les données EST complètes et partielles, les données de sortie de Glimmer et de FgenesH ont été fusionnées manuellement pour générer une prédiction robuste du complément du gène M. hapla. Une description complète des méthodes utilisées pour la découverte et l'annotation de classes et de familles particulières de gènes, de caractéristiques de génome et d'éléments fonctionnels est fournie dans les méthodes SI.